کلونینگ ژن آلفا آمیلاز در وکتور انتقالیpgfk114.1 اشرشیاکولی - باکتروییدی

با افزایش رقابت در صنعت دامپروری، تولید کنندگان از تکنولوژی dna نوترکیب همانند ایجاد باکتری های نوترکیب با منشاء شکمبه ای بهره می گیرند. بدین ترتیب با کاهش معایب افزودنی های آنزیمی باعث افزایش بازدهی نشخوارکنندگان می شوند. روش های انتقال ژن همانند ترانسفورماسیون و ترانس داکشن در شکمبه به علت فراوانی اندونوکلئازها در مایع شکمبه و با ایزوله نشدن باکتریوفاژها بعید به نظر می رسد در حالی که کانژوگاسیون کاربردی ترین سیستم انتقال ژن در شکمبه گزارش شده است. در این تحقیق برای اولین بار کلونینگ ژن آلفا آمیلاز در یک وکتور ساختگی pgfk114.1 صورت گرفت. ژن آلفا آمیلاز مورد استفاده از یک باکتری باسیلوسی جداسازی و در وکتور بیانی pet28aکلون شده بود که با توجه به دارا بودن خصوصیت آنزیمی متناسب با محیط شکمبه مورد استفاده قرار گرفت. بدین منظور ابتدا پرایمر برای تکثیر مورد نظر و انجام کلونینگ در وکتور انتقالی، طراحی شد. پس از تکثیر، ژن در وکتور e.coliکانژوگاسیون صورت گرفت که جهت این عمل نیاز به وکتور کمکی prk231 بود که به همراه وکتور انتقالی به روش مذکور انتقال صورت گرفت. جهت تائید انتقال و بیان ژن در باکتری شکمبه ای، غربالگری و جداسازی باکتری های بی هوازی از جمله باکتروئید صورت گرفت و سپس کانژوگاسیون بین سویه های e.coli و باکتروئیدهای جدا شده انجام پذیرفت و یکی از باکتروئید ها که فاقد ژن آمیلاز بود قادر به دریافت و بیان ژن پس از انجام کانژوگاسیون شد که نتیجه فوق با ژن مارکر مقاومت به آنتی بیوتیک سفوکسیتین تآیید گردید. جهت شناسایی باکتروئید فوق طراحی پرایمرrrna 16s انجام گرفت.